濾紙糖化力法測定纖維素酶活性條件的研究

       今天喆圖小編就來說說利用蛋白質分離純化方法，從枯草芽孢桿菌中分離出纖維素酶，將其分別作用于羧甲基纖維素（CMC）和濾紙，其生成的還原性糖能和3.5--二硝基水楊酸（DNS）反應生成棕紅色物質，利用分光光度法測出纖維素酶的活性強度。

           纖維素酶 

濾紙糖 ———— 纖維二糖、葡萄糖等還原性糖 +DNS ———— 棕紅色物質

所需藥品材料：氫氧化鈉、葡萄糖、3.5--二硝基水楊酸（DNS）、硝酸、冰醋酸、醋酸鈉、酒石酸、濾紙、纖維素酶制劑。

試驗需用儀器：分光光度計、電熱恒溫水浴鍋、鼓風干燥箱、分析天平

實驗設計：

一、實驗前期準備工作:

       1、醋酸-醋酸鈉緩沖液的配制：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1mol/L醋酸溶液。 稱取8.2g醋酸鈉，溶解后容至1000ml，制成0.1mol/L醋酸鈉溶液。使用時以4：6的比例混合，放入低溫保存箱中冷藏備用。

         2、葡萄糖溶液的配制：將葡萄糖在鼓風干燥箱中105℃下干燥至恒重，準確稱取100mg 于100mL 小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入100mL 容量瓶中用蒸餾水定容至100mL，充分混勻。

         3、3.5--二硝基水楊酸的配制：準確稱取DNS 6.3g于500mL 大燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶液262mL，再加到500mL 含有185g 酒石酸鉀鈉（C4H4O6KNa · 4H2O，MW=282.22）的熱水溶液中，再加5g結晶酚（C6H5OH，MW=94.11）和5g無水亞硫酸鈉（Na2SO3，MW=126.04），攪拌溶解，冷卻后移入1000mL 容量瓶中用蒸餾水定容至1000mL，充分混勻。

          4、葡萄糖標準曲線的繪制：取8支洗凈烘干的25mL 具塞刻度試管，編號后依次加入0ml 0.2ml 0.4ml 0.6ml 0.8ml 1.0ml 1.2ml1.4ml葡萄糖標準溶液,然后用蒸餾水分別定容至2.0ml。配制成一系列不同濃度的葡萄糖溶液。充分搖勻后，向各試管中加入1.5mL DNS溶液，搖勻后放入水浴鍋中沸水浴5min，取出冷卻后用蒸餾水定容至25mL，充分混勻。在540nm 波長下，以1號試管溶液作為空白對照，調零點，測定其它各管溶液的光密度值并記錄結果。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，以對應的光密度值為縱坐標，在坐標紙上繪制出葡萄糖標準曲線。

二、濾紙對實驗的影響分析：由于濾紙中也含有一定量的還原性糖，所以試驗中應該排除底物對實驗的影響。稱取等量碾碎的濾紙與DNS充分反應，測其OD值。

三、酶促反應時間的研究：酶的反應時間不同，其產物濃度也不一樣。依次取反應時間為0min 2min 4min 6min 8min 10min 12min14min的反應體系，加入DNS充分顯色測其OD值。

四、DNS試劑量的確定：DNS本身也具有一定的顏色，如果過量也會對實驗結果造成影響，所以應該設計實驗確定DNS的加入量。取相同酶反應體系，分別加入0.3ml 0.6ml 0.9ml 1.2ml 1.5ml 1.8ml 2.1ml 2.4ml顯色劑DNS充分顯色，測其OD值。

五、吸收波長的確定：取450nm-590nm波長段，以每20nm一個區段，分別測其OD值，分析結果。

六、沸水浴顯色時間的確定：取相同酶反應體系，DNS沸水顯色分別取1min 3min 5min 7min 9min 11min 13min 15min的OD值，分析結果。

七、顯色后吸光度穩定性的研究：分別測量反應體系顯色后15min 20min 25min 30min 35min 40min 45min 50min的吸光度，分析結果。

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