細(xì)胞電轉(zhuǎn)染的步驟

   轉(zhuǎn)染是真核細(xì)胞主動或被動導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。電擊完成后用恒溫培養(yǎng)箱進行測試也是很關(guān)鍵的步驟，下面給大家介紹下電轉(zhuǎn)染詳細(xì)步驟。

1.清洗電轉(zhuǎn)杯，將電轉(zhuǎn)杯置于75%酒精中浸泡2小時，然后在紫外燈下照射后即可使用。

2.電穿孔前一天，以合適密度傳代細(xì)胞，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前出于對數(shù)生長期。對于原代培養(yǎng)細(xì)胞，一般培養(yǎng)2-3天后，細(xì)胞單層融合度可以達到70-80%，即可開始試驗。

3.PBS洗細(xì)胞2次后，胰酶消化細(xì)胞2min，待細(xì)胞變圓后，用*培養(yǎng)基終止消化。

4.輕輕吹下細(xì)胞成單細(xì)胞懸液后，1200rpm室溫離心5min。

5.*棄去上清，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量，加入適量的電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細(xì)胞（一般為0.5-0.6ml左右），并上下吹打均勻。

6.加入適量相應(yīng)濃度的待轉(zhuǎn)染核酸至相應(yīng)的終濃度（質(zhì)粒為20ug/ml，SiRNA的終濃度為100nM），上下吹打均勻。若以0.5ml計算，所需質(zhì)粒為0.5×20=10ug。

7.將含有相應(yīng)濃度核酸的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入相應(yīng)規(guī)格的電轉(zhuǎn)杯中，按照預(yù)定條件設(shè)置參數(shù)，進行電擊操作。

8.電擊完成后，將電轉(zhuǎn)杯置于恒溫培養(yǎng)箱中8-12min，以使核酸充分進入細(xì)胞。

9.將電擊杯從恒溫培養(yǎng)箱中取出，接種細(xì)胞懸液于預(yù)熱的培養(yǎng)基中，上下吹打均勻后，置于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。

10.正常培養(yǎng)4h，待細(xì)胞貼壁后，給細(xì)胞換新鮮的*培養(yǎng)基，以去除上層的死細(xì)胞。

11.培養(yǎng)24h后,即可進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的檢測或是進行細(xì)胞的實驗處理。