微生物菌種保存方法

        傳代保存法

        有些微生物當遇到冷凍或干燥等處理時，會很快死亡，因此在這種情況下，只能求助于傳代培養保存法。傳代培養就是要定期地進行菌種轉接、培養后再保存，它是基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產菌種的保存。

        傳代保存時，培養基的濃度不宜過高，營養成分不宜過于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應在可能的范圍內盡量降低。培養溫度通常以稍低于適生長溫度為好。若為產酸菌種，則應在培養基中添加少量碳酸鈣。

        一般地，大多數菌種的保藏溫度以5℃為好，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃培養箱進行保存，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。傳代培養保存法雖然簡便，但其缺點也很明顯，如：

①菌種管棉塞經常容易發霉;

②菌株的遺傳性狀容易發生變異;

③反復傳代時，菌株的病原性、形成生理活性物質的能力以及形成孢子的能力等均有降低;

④需要定期轉種，工作量大;

⑤雜菌的污染機會較多。

        液體石蠟覆蓋保存法

        該法較前一種方法保存菌種的時間更長，適用于霉菌、酵母菌、放線菌及需氧細菌等的保存。此法可防止干燥，并通過限制氧的供給而達到削弱微生物代謝作用的目的。

        其具有方法簡便的優點，同時也適用于不宜冷凍干燥的微生物(如產孢能力低的絲狀菌)的保存，而某些細菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜采用此法進行保存。

        載體保存法

        即將微生物吸附在適當載體上進行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種，如：

        ①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液，立即在室溫下進行干燥或使菌體繁殖后再干燥，然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜，土壤需風干、粉碎、過篩和滅菌。

使微生物在土壤中繁殖后進行干燥保存的方法是：取適量土壤(5克)，置于塞有棉塞的試管中，加水或加入充分稀釋的液體培養基(以含水量為土壤大持水量的60%為宜)，然后高壓滅菌。再將需保存的微生物進行大量接種，培養至菌絲能用肉眼確認的程度為止，移入干燥器中經短時間干燥或風干后密封，冷藏或室溫保存。

        ②砂土保存法：取清潔的砂，篩去掉大砂粒，并用磁鐵吸去砂中鐵屑，再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗數次，干燥后，置于試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經干熱滅菌后，加入1mL菌種培養液，經充分混勻后，放入真空干燥器中，*干燥后熔封保存。也可用二份洗凈的砂(經HCl預處理)和一份貧瘠、過篩的黃土攙和后滅菌，再進行菌種保藏。

        ③硅膠保存法：以6～16目的無色硅膠代替砂子，干熱滅菌后，加入菌液。加菌液時，由于硅膠的吸附熱常使溫度升高，因而需設法加以冷卻。

        ④磁珠保存法：將菌液浸入素燒磁珠(或多孔玻璃珠)后再進行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠(或無水CaSO4)，上鋪玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，經干熱滅菌后，接入菌懸液，后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。本法對酵母菌很有效，特別適用于根瘤菌，可保存長達兩年半時間。

        ⑤麩皮保存法：在麩皮內加入60%的水，經滅菌后接種培養，后干燥保藏。

        ⑥紙片(濾紙)保存法：將滅菌紙片浸入培養液或菌懸液中，常壓或減壓干燥后，置于裝有干燥劑的容器內進行保存。

        懸液保存法

        即使微生物混懸于適當溶液中進行保存的方法。常用的方法有：

        ①蒸餾水保存法：適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線菌，將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數年。本法應注意避免水分的蒸發。

        ②糖液保存法：適用于酵母菌，如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗處保存，可長達10年。除此之外，也可使用緩沖液或食鹽水等進行保存。

        寄主保存法

        即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。用于目前尚不能在人工培養基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內感染并傳代，此法相當于一般微生物的傳代培養保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進行保藏。

        冷凍保存法

        適用于抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體細胞外遭受凍結的情況下而不受損傷，而對其它大多數微生物而言，無論在細胞外凍結還是在細胞內凍結，都會對菌體造成損傷，當采用這種保藏方法時，應注意以下幾點：

        ①要選擇適于冷凍干燥的菌齡細胞。

        ②要選擇適宜的培養基，因為某些微生物對冷凍的抵抗力，常隨培養基成分的變化而顯示出巨大差異。

        ③要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長。

        ④菌液內不添加電解質(如食鹽等)。

        ⑤可在菌液內添加甘油等保護劑，以防止在冷凍過程中出現菌體大量死亡的現象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護劑時更有效。

        ⑥原則上應盡快進行冷凍處理，但當加入保護劑時，可靜置一段時間后再進行處理。

        ⑦就動物細胞而言，應在-20℃范圍內以1℃/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對絕大多數微生物而言，則不必如此，如結構較為復雜的原蟲則可在-35℃范圍內進行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍。

        ⑧若進行長期保存，則貯藏溫度越低越好。

        ⑨取用冷凍保存的菌種時，應采取速融措施，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應選擇靜置融化的措施。當冷凍菌融化后，應盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降。

        常用的冷凍保存法包括：

        ①低溫冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃)：

低溫冷凍保存時使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時菌液加量不宜過多，有些可添加保護劑。此外，也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內，再放入低溫冰箱內進行保存的。

        ②干冰保存法(-70℃左右)：

即將菌種管插入干冰內，再置于冰箱內進行冷凍保存；

        ③液氮保存法(-196℃)：

是適用范圍廣的微生物保存法。

其操作步驟如下：

        a、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當防凍劑(保存霉菌不用防凍劑)的滅菌溶液中，將0.2～1mL的這種溶液分裝于安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或將菌絲體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。

        b、熔封安瓶管：若直接貯存于氣相液氮中(-150℃～-170℃)時，則不需熔封。

        c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，將熔封安瓶管在適當的色素溶液中浸泡2～30分鐘后，觀察有無色素進入安瓶。

        d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮氣以約1℃/min的速度冷卻至-25℃左右，也可在-20℃～-25℃的冰箱內緩慢冷卻30～60min。

        e、速冷：后浸入液氮中快速冷卻至-196℃。

        冷凍干燥保存法

        其原理是首先將微生物冷凍，然后在減壓下利用升華現象除去水分。事實上，從菌體中除去大部分水分后，細胞的生理活動就會停止，因此可以達到長期維持生命狀態的目的。該方法適用于絕大多數微生物菌種(包括噬菌體和立克次氏體等)的保存。在進行冷凍干燥時，需注意以下幾個問題：　

        a、冷凍干燥前的培養條件：首先檢驗菌種純度。一般地說，將待保存的微生物在營養豐富且容易增菌的培養基上進行培養為宜;菌齡以達到對數生長期為好;若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以后進行保存為好;菌液濃度以高為好，如細菌應達到109～1010/mL。

        b、菌株號碼等的標記：可在安瓶外側標記或在安瓶內封入標簽。

        c、安瓶的準備：將安瓶在2%HCl中浸泡過夜，自來水沖洗3次后，蒸餾水刷凈，干燥，塞棉塞，貼標簽，干熱滅菌或溫熱滅菌后，60℃恒溫干燥。

        d、添加保護劑：常用的保護劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等。甘油管保藏法：在5mL菌種保藏管中，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后，于-20℃冰箱中保存。

        甘油管保藏法

在5ml菌種保藏管中，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后，于-20℃冰箱中保存。

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