Transwell遷移/侵襲實驗

        基本原理

        將Transwell小室放入培養板中，小室內稱上室，培養板內稱下室，上室內盛裝上層培養液，下室內盛裝下層培養液，上下層培養液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細胞種在上室內，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞，從而可以研究下層培養液中的成分對細胞生長、運動等的影響。

        應用不同孔徑和經過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。侵襲實驗中使用到的Matrigel 是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養基中重建形成膜結構，這種膜結構與天然基質膜結構極為相似。

        Transwell小室的濾膜孔徑一般為8μm，在侵襲實驗中，膜孔都被Matrigel覆蓋，細胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運動才能穿過這種鋪有Martrigel 的濾膜，這與體內情況較為相似。細胞欲進入下室，先要分泌基質金屬蛋白酶（MMPs）將基質膠降解，方可通過聚碳酸酯膜。計數進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的侵襲能力。

        所需材料

ØTranswell小室

Ø細胞生長培養基

Ø胎牛血清

Ø胰蛋白酶

ØPBS

Ø青霉素-鏈霉素溶液（100×）

Ø結晶紫或臺盼藍

Ø甲醇

ØMatrigel（侵襲實驗）

        主要試劑配置

（1）PBS磷酸鹽緩沖液： PBS粉劑每袋加ddH2O定容至1000ml，調pH7.2，121℃，30min，高壓滅菌，4℃保存。

（2）細胞生長培養基：低溫培養箱-20℃保存，臨用前按體積比配成含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素雙抗的*培養液。

        操作步驟

1．所有細胞培養試劑和細胞培養池放在電熱恒溫培養箱內37℃溫育；

2．待測細胞培養至對數生長期，消化細胞，用PBS和無血清培養基先后洗滌1次，用無血清培養基懸浮細胞，計數，調整濃度為2×105 /ml；

3．如進行侵襲實驗，將Matrigel膠從-20℃取出于4℃冰箱過夜，在4℃條件下將Matrigel膠用無血清的細胞培養基稀釋至300 μl/ml，取100 μl均勻涂抹一層于細胞培養池的PET膜上表面，然后將培養池輕輕放入24孔板孔內，37℃放置3 h左右，取出于超凈工作臺過夜干燥。

注：如進行遷移實驗，則跳過這一步驟

4．在下室（即24孔板底部）加入600－800 μl 含10％血清的培養基，上室加入100－150 μl細胞懸液，繼續在孵箱培養24 h；

5．將其下表面浸泡在70%甲醇溶液中，固定30 min~60 min，用結晶紫或臺盼藍染色，鏡檢，并計算PET膜下表面的細胞數，計算中間和四周5個視野，取平均值。

        實驗結果

鏡下對染色后的細胞進行計數，計數值高，則該組細胞遷移/侵襲能力強。

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