實驗室質粒DNA提取實驗

       在我們的細胞實驗中經常會用到質粒DNA，現在都用劑盒非常方便，而且菌體培養后，可以多管濃縮提取，提到的質粒量多，可以-20℃保存，以后用于酶切、轉化等實驗，可以提前跑個膠，只要不降解，就可以繼續用，避免每次要用，都要培養一遍再提取一遍。

        質粒DNA的提取

        質粒多為一些雙鏈、環狀的DNA分子，是獨立于細菌染色體之外進行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。質粒是進行分子生物學實驗操作，進行遺傳工程改良物種等工作時MAX主要的DNA載體。

        實驗步驟

        1.搖菌培養

1）將鑒定測序正確的克隆菌液涂在LB固體平板。

2）置于37℃恒溫培養箱，培養12-17h，待長出菌落。

3） 滅菌15ml離心管內加入5ml含抗生素的LB液體培養基，編號標記。

4） 挑取單克隆菌團放置液體培養基，每個培養基放置1個菌落。

5） 37℃，180rpm，振蕩培養過夜。

        2.收獲細菌并裂解

1） 離心擴增好的菌液，按說明書將菌液重懸，轉入1.5ml離心管中。

2）用質粒小量抽提試劑盒，按說明書要求提取質粒。

3） 細菌高速離心1min,*去除上清。

4）加入250ulRB溶液，振蕩器充分懸浮細菌。

5）加入250ulLB溶液。立即上下顛倒10次，使細菌裂解，室溫，放置2min。

6）加入250ulNB溶液。立即上下顛倒10次，使之充分中和，室溫，放置2min。

7）室溫，1500rpm，高速離心15min。

8）將吸附柱放入收集管內，離心得到的上清轉移至吸附柱，室溫，15000rpm，高速離心30s。

9）棄廢液，將吸附柱放入收集管，加入700ul WB溶液到吸附柱中，15000rpm，高速離心30s。

10）重復上一操作。

11）將吸附柱放入干凈的1.5ml 離心管中，加30-50ul預熱的Elution Buffer，室溫，放置2min，高速離心1min。

12）樣品進行電泳檢測：1%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為2ul，紫外燈下觀察，MAX明亮的帶為超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取質粒的純度。

        3.質粒的純化

1）將之前提取好的質粒放入1.5ml離心管中，加入1/10體積的3mol/L 無菌乙酸鈉溶液。

2）加入2倍體積的無水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或過夜。

3）4℃，高速離心機14000rpm，離心20min.

4）棄去上清，70%乙醇洗2次。

5）空氣干燥，可置超凈工作臺干燥。

6）加200ul無菌水溶液干燥后所得沉淀，即為質粒溶液。

7）紫外分光光度計測量質粒濃度和產量。

測量OD260和OD280的值：質粒DNA濃度=OD260×50×稀釋倍數（μg/mL）。

        10個常見問題

        一.時間控制問題

        裂解時間太長，加入溶液P2后裂解時間不應超過5 分鐘；吸附時間不夠；溶解時間不夠都會導致質粒DNA提取實驗失敗。

        二.大腸桿菌老化

        建議涂布平板培養后，重新挑選新菌落進行液體培養。

        三.質粒拷貝數低

        由于使用低拷貝數載體引起的質粒DNA 提取量低，可更換具體相同功能的高拷貝數載體。

        四.溶液使用不當

        溶液P2、P3 在溫度較低時可能出現渾濁，應置于37℃培養箱保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。

        五.吸附柱過載

        不同產品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質粒量很大，請分多次提取。若用富集培養基，例如TB 或者 ×YT 菌液體積必須減少；若質粒或宿主菌是非常高的拷貝數或生長率，則需調整LB 培養液體積。

        六.質粒未全部溶解

        洗脫溶解質粒時，可適當加溫或延長溶解時間。

        七.乙醇殘留

        漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗后應晾干樹脂，再加入洗脫緩沖液。

        八.洗脫液加入位置不正確

        洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會*覆蓋硅膠膜的表面達到MAX大洗脫效率。

        九.洗脫液不合適

        DNA 只在低鹽溶液中才能被洗脫。洗脫效率取決于pH 值。MAX大洗脫效率在pH7.0～ 8.5 間。當用水洗脫時確保其 pH 值在此范圍內，如果pH 過低可能性導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加暖至 60 ℃后使用有利于提高洗脫效率。

        十.洗脫體積太小

        洗脫體積對來回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

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