用電熱恒溫培養箱培養大腸桿菌

實驗所需儀器：超凈臺、離心機、高壓滅菌鍋、電熱恒溫培養箱、磁力攪拌器、培養皿、涂布器、移液管、移液器

實驗所需試劑：牛肉高蛋白胨培養基相關試劑、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理鹽水

2.2實驗方法

2.2.1制備培養基 

　　普通培養基——牛肉高蛋白胨培養基（400ml）：

牛肉高5g蛋白胨10gnacl5g瓊脂20g蒸餾水1000mlph7.0

　　按配方配制好培養基后置于滅菌鍋中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5組+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml

　　篩選培養基(200ml)：含抗生素50mg/L。（卡那霉素屬于氨基糖苷類抗生素，能結合細菌核糖體的30s亞基上的16srRnA，阻斷細菌蛋白質的合成。）

　　牛肉高5g蛋白胨10gnacl5g瓊脂20g蒸餾水1000mlph7.0硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）0.2ml，按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃15min滅菌，取出培養基后冷卻至60℃時將硫酸卡那霉素0.2ml加入培養基中，充分震蕩混勻，倒平板，2皿*15ml*5組+2皿*15ml=12皿*15ml=180ml2.2.2制備菌懸液（106~108個/mL）

　?、俟腆w培養：大腸桿菌劃線或涂布接種于固體培養基，37℃培養24-48h。

　?、诰鷳乙海河眠m量生理鹽水刮洗菌落，倒入一個無菌小三角瓶（或試管）中，充分振蕩使菌

　　體散開，得到菌懸液。

　　③菌懸液濃度用血球計數板計數

　　使用細菌計數板或血球計數板在顯微鏡下直接計數。將菌液滴在血球計數板0．1ml的計數格中，細菌被固定染色后，在顯微鏡下選擇數出若干個小格中的細菌數目，（一般數125個小格），根據比例關系折算出單位體積菌液中細菌的數量。

　　血球計數板規格：計數格=4*4=16大格1大格=5*5=25小格

　　小格體積=0.05*0.05*0.1=0.00025mm3=2.5*10-7ml(長*寬*高)

　　計算方法例如：125格中90個細菌，則（90÷125）÷（2.5*10-7）個/ml=2.88*106所以，125格中的細菌大約在31(4格1個菌)—3125（每個小格25個菌）個。2.2.3誘變處理及接種

　?、賹⒆贤鉄舸蜷_，預熱30min；

　?、谌o菌培養皿（Φ90mm，含無菌大針），加入稀釋好的菌懸液8ml以覆蓋培養皿底面為宜。

　　③將待處理的培養皿置于誘變箱內的磁力攪拌儀上，開啟磁力攪拌儀旋紐進行攪拌1分鐘，然后打開皿蓋，分別處理10s、20s、40s、80s、160s（可以累積照射），照射完畢后先蓋上皿蓋，再關閉攪拌和紫外燈；

　?、苊總€照射劑量分別取0.5ml分別稀釋1000倍和100倍，然后取稀釋液0.1ml

　　做普通培養基的涂布培養，每個處理兩個重復；同時每個照射劑量取0.1ml照射液直接做兩個篩選培養基的涂布培養。⑤對照涂布培養：將照射的菌液稀釋1000倍，在稀釋液中取0.1ml做2個普通培

　　養基涂布培養，2個篩選培養基的涂布培養。涂布要均勻，培養基表面無液流。⑥37℃培養24h后，計數，統計分析。對于篩選的抗性菌種進行驗證、純化。

　　2.2.4.結果計數、分析、統計及討論

　?、僖暂椛鋾r間為橫坐標，以存活菌落數的lg值為縱坐標，作紫外線對大腸桿菌致死效應曲線。

　?、诹泄接嬎悴煌椛鋭┝肯碌闹滤缆省?/p>

　　照射前活菌數/ml?照射后活菌數/ml

　　照射前活菌數/ml

　　③計算并比較不同輻射劑量下大腸管桿菌的抗藥突變率，并分析不同輻射劑量的誘變效果差異原因

　　突變率=篩選平板菌數/普通平板菌數*100%④抗藥性菌株的篩選與純化

　　將一抗性克隆劃線到一新的抗性平板上，與對照菌相比較，觀察生長狀況