NK細胞培養與優化

       因NK細胞是一種比較難培養的細胞。培養過程會涉及很多問題，如：細胞接種密度如何？NK細胞有哪些特性？NK細胞具有哪些形態特征？......

       使用的NK細胞培養套裝為無飼養層細胞體外擴增技術，以外周血單個核細胞（PBMC）為起始種子細胞，結合多種細胞因子的誘導和刺激，實現NK細胞體外特異性的高效擴增。具有適用性強，對種子細胞的來源選擇性好，不需包被；無飼養層培養工藝，簡化操作，提高產品安全性；使用多種細胞因子及小分子物質聯合刺激，充分活化效應細胞等技術優勢。

       試劑：NK細胞培養套裝；

       耗材：培養瓶；細胞培養袋；移液管；采血袋等。

       操作過程：

       D0：白細胞層分離培養及誘導

       臍血經病毒檢測合格后，送入實驗室中。取70ml臍血，按常規的血漿及PBMC分離方法分離獲得血漿和白細胞層。白細胞層經洗滌，計數為7.4*107，以1.5*106個/ml密度接種在培養瓶中。加入誘導培養基、因子及滅活血漿，放置在37℃，5%CO2的二氧化碳培養箱中培養。

       注意事項：

       1、臍血盡可能采集新鮮血液，否則容易凝血；

       2、需注意Ficoll的溫度，否則易混雜較多紅細胞；

       3、注意離心的升降速設置，否則無法獲得白細胞層。

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       D2：顯微鏡下觀察細胞生長狀況：

       細胞經誘導刺激，有明顯的半貼壁聚團生長，部分細胞聚團懸浮生長。細胞略有增殖，增殖不明顯。

       20*物鏡

       D3：細胞觀察并補充誘導培養基

       細胞經過二氧化碳培養箱培養，半懸浮貼壁較D2增多，細胞聚團更為明顯。

       注意事項：前3天不能劇烈晃動細胞，避免干擾細胞成團。

       10*物鏡

       D5：細胞觀察并補充增殖培養基

       經過兩天的培養，半懸浮貼壁的細胞已開始懸浮于培養基中，培養基顏色變黃。細胞計數為1.1*106/ml，補充增殖培養基，刺激NK細胞增殖。

       10*物鏡

       D7：細胞觀察并補充增殖培養基

      培養基顏色變黃，顯微鏡下可明顯看到細胞聚團增大。細胞計數為2.0*106/ml，補充增殖培養基，調整細胞密度，刺激NK細胞增殖。細胞轉移至培養袋中培養。略微吹打細胞，使細胞團略微分散。輕晃培養袋，使細胞分散培養。

       10*物鏡

       D9：細胞觀察并補充增殖培養基

       培養袋中培養基變黃，取細胞計數并將細胞放置在細菌皿中觀察形態，發現細胞已基本分散生長。細胞計數為1.5*106/ml，補充培養基。

       10*物鏡

       D11：細胞觀察并補充增殖培養基

       培養袋中培養基變黃，取細胞計數并將細胞放置在二氧化碳培養箱中觀察形態，發現細胞已呈不規則形態，部分細胞有觸角伸出。細胞計數為1.7*106/ml，補充培養基。

       10*物鏡                                                            

       40*物鏡

       D12：細胞觀察并補充增殖培養基（本次非常規補液）

       培養袋中培養基變黃，取細胞計數并將細胞放置在細菌皿中觀察形態，細胞形態與D11基本類似，取細胞進行流式細胞檢測。細胞計數為1.5*106/ml，補充培養基。

       流式細胞檢測：CD3-/CD16+CD56+為82.74%

       10*物鏡                                                            

       40*物鏡

       D12-NK細胞流式檢測結果

       D14：細胞檢測

       培養袋中培養基變黃，取細胞計數并將細胞放置在細菌皿中觀察形態，取細胞進行流式細胞檢測。細胞計數為2.0*106/ml。

       流式細胞檢測：CD3-/CD16+CD56+為90.98%

       10*物鏡                                                          

       40*物鏡

       D14-NK細胞流式檢測結果

       (一)X-VIVO無血清造血細胞培養基

       這個系列是屬于化學成分限定培養基，為包括淋巴因子激活殺傷細胞(LAK)、外周血淋巴細胞(PBL)和腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)在內的多種細胞提供營養完整和平衡的環境。此類培養基不包含任何外源性生長因子、人工促進細胞增殖的物質或未定義的補充物。它們不含任何蛋白激酶C刺激因子，適用于研究人類和小鼠淋巴細胞激活中的第二信使系統。

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