細胞瞬時轉染原理及實驗步驟

       細胞復蘇

       細胞復蘇是將保存在液氮或-80℃冰箱中的細胞株解凍并重新培養的過程。細胞復蘇的關鍵是快速。防止在解凍過程中，產生的水珠形成冰晶損傷細胞。細胞復蘇一般步驟如下：

       1. 預先加熱水浴鍋，溫度至 37-40℃，并在離心管中準備好 10mL 培養基

       2. 從液氮罐或冰箱中取出細胞，迅速放進預熱的水浴鍋中，鑷子夾住凍存管晃動，使其受熱均勻

       3. 當凍存管內*融化時，注意用酒精擦拭凍存管消毒，將液體倒入含有 10mL 培養基的離心管中

       4. 離心 5min，去除上清，得到沉淀

       5. 用培養基懸浮沉淀，并接種到培養瓶常規細胞培養

       細胞復蘇后，生長一段時間，95%的細胞貼壁生長，細胞狀態良好，說明細胞復蘇成功。

       

       瞬轉步驟

       以 Lipofectamine 轉染試劑為例的操作流程，不同轉染試劑參考說明書

       1. 將復蘇后常規培養的細胞按照 1-3x105 接種到 6 孔板中，加入 2-4mL 的*培養基，混勻放置在氣套式二氧化碳培養箱中 37℃過夜

       2. 無菌狀態下配置如下溶液：

       a 用 100ul 的無血清培養基稀釋 2ug 的待轉染的質粒

       b 用 100ul 的無血清培養基稀釋 25ul 的 Lipofectamine 轉染試劑（血清的存在會影響細胞轉染效率，因此要使用無血清培養基轉染）

       3. 將 ab 溶液混合并搖勻，室溫下放置 30min 左右

       4. 細胞培養至 80%單層左右，用無血清培養基洗滌細胞 2 次，每孔加入 1mL 的無血清培養基，并將混合后的 ab 溶液逐滴加入到每孔，按十字方向輕搖混勻，氣套式二氧化碳培養箱中 37℃培養 24 小時

       5. 將轉染液倒出，換為*培養基繼續培養，培養 3-4 天后檢測蛋白表達量

       轉染檢測

       收集培養的細胞，采用超聲或酶解的方法破碎細胞，離心得到上清。轉染后的檢測主要包括基因水平和蛋白水平的檢測。針對基因水平，使用普通 PCR 或 RT-PCR 進行驗證，或可使用先達基因ERA法進行檢測，簡單，快速，準確。蛋白水平，使用 western blot 檢測。