噬神經(jīng)元的腺病毒載體的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)試劑

人類胚胎腎（HEK）293T細(xì)胞

腺病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒

腺病毒包裝載體PLP1，pLP2（之前），PLP / VSVG

DMEM培養(yǎng)基

青霉素，鏈霉素-谷氨酰胺（100X）

磷酸鹽緩沖液PBS（-）

胎牛血清

凝聚胺
實(shí)驗(yàn)設(shè)備

10-cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿

50毫升錐形離心管

Steriflip-GP過濾器（0.22微米）
超離心管17.0mL

5％二氧化碳培養(yǎng)箱

熒光顯微鏡

生物安全柜

離心機(jī)

 
實(shí)驗(yàn)材料

2.5M氯化鈣溶液：36.75克氯化鈣，70毫升雙蒸H 2 O，通過0.22μm濾膜過濾，體積調(diào)制100毫升

2X HEPES緩沖：氯化鈉280 mM，50mM肝素鈉，1.5mM的Na2 HPO4 (pH值7.05）
實(shí)驗(yàn)步驟

腺病毒載體的構(gòu)建和濃度

第1天： HEK細(xì)胞的培養(yǎng)

1．收集預(yù)融合的HEK 293T細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)于*DMEM培養(yǎng)基中（含10％FBS，50 U/ml的青霉素G和50μg/mL鏈霉素的，pH值7.35）。

2．將收集的濃度為1×106 的HEK 293T細(xì)胞接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿中，加入10mL*DMEM培養(yǎng)基。漩渦震蕩使細(xì)胞均勻分布， 37℃培養(yǎng)24h。

第2天：轉(zhuǎn)染

3．觀察第1天培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞應(yīng)鋪滿約60％。

注意：細(xì)胞長滿80％會導(dǎo)致收獲病毒時(shí)PH偏低。

4．更換DMEM培養(yǎng)基（10％FBS，10mL），繼續(xù)孵育于二氧化碳培養(yǎng)箱30min。

5．將10µg腺病毒轉(zhuǎn)移載體與10µg包裝混合物混合，用無菌ddH2 O稀釋質(zhì)粒至總體積450μL。

6．向質(zhì)粒中加入50μL 2.5 M氯化鈣混勻，然后加入500μl 2xHEPES緩沖液，渦旋。

7．將所有的轉(zhuǎn)染混合物加入（散開）培養(yǎng)板，輕輕震蕩，繼續(xù)培養(yǎng)于5％二氧化碳培養(yǎng)箱過夜（16h）。

第3天：觀察細(xì)胞和更換培養(yǎng)基

8．觀察細(xì)胞

注意：細(xì)胞不能達(dá)到飽和狀態(tài)，應(yīng)該有供細(xì)胞分裂生長的空間，因?yàn)榧?xì)胞鋪滿后培養(yǎng)基的pH值會迅速下降。

9．吸出培養(yǎng)基，加入5mL預(yù)熱的PBS（-）洗兩次細(xì)胞，然后加入9.5mL新鮮培養(yǎng)液的DMEM培養(yǎng)基， 5％CO 2 培養(yǎng)箱繼續(xù)培育，37℃過夜。

第4天：收獲細(xì)胞和濃縮病毒顆粒

10．轉(zhuǎn)染40h后收集上清液。

注意：收集時(shí)培養(yǎng)基顏色應(yīng)該是紅色的（酚紅的顏色），（pH值7.20或更高）在這個(gè)pH值內(nèi)病毒培養(yǎng)較好，因此，不要使用從第二次收獲的細(xì)胞。為了獲得優(yōu)先轉(zhuǎn)染膠質(zhì)細(xì)胞的腺病毒載體，應(yīng)使用病毒轉(zhuǎn)染后2d或3d的細(xì)胞。此外，最好使用充足胎牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞。

11．通過0.22微米的過濾器過濾，清除上清液中的細(xì)胞碎片。

12．超速離心濃縮病毒顆粒。4℃，用吊桶式轉(zhuǎn)頭離心上清120000xg，1.5h。將2個(gè)培養(yǎng)板（約18mL）的上清濃縮于一管。

13．倒掉上清液，沉淀幾乎看不見。

14．用90μL PBS（-）重懸病毒顆粒。病毒懸浮液，可用于在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：但是，如果需要純凈級的質(zhì)量，可通過如下步驟純化病毒。

腺病毒載體滴度的測定

腺病毒載體的滴度通過HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)染來測定。雖然滴度可以在13步后就可以計(jì)算，但為了縮短整個(gè)過程我們通常從第3天開始計(jì)算。

第3天：HeLa細(xì)胞播種

15．將 1×105 的的HeLa細(xì)胞接種于含1mLDMEM培養(yǎng)基（10％FBS）的12孔板，添加聚凝胺至濃度為6 µg/ml。在5％CO2 培養(yǎng)箱孵育，37℃過夜。

第4天：腺病毒載體的感染HeLa細(xì)胞

16．用PBS 10倍梯度稀釋的病毒（稀釋從10 -3 到10 -6 ）。實(shí)際測試的范圍將取決于病毒制劑的濃度。17．將每個(gè)梯度稀釋的病毒加入單層生長的HeLa細(xì)胞，輕輕搖勻， 337℃培養(yǎng)。

第5-8天：腺病毒載體的滴度測定

18．細(xì)胞再生長3天（感染后總88h），綠色熒光蛋白染色后48h可見。然而，這個(gè)時(shí)間根據(jù)滴定用腺病毒載體和細(xì)胞株不同而有所不同。

19．檢測標(biāo)記細(xì)胞百分比：如果標(biāo)記是綠色熒光蛋白，計(jì)數(shù)綠色熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞。

20．如前所述計(jì)算生物滴度（TU/ml，轉(zhuǎn)染單位）。