關于細胞劃痕法的詳細介紹

細胞劃痕(wound healing）法是簡捷測定細胞遷移運動和修復能力的方法。
一、原理
在體外培養皿或平板培養的單層貼壁細胞上，用微量槍頭或其它硬物在細胞生長的中央區域劃線，去除中央部分的細胞，然后繼續培養細胞至實驗設定的時間，取出細胞培養板，在顯微鏡下觀察并拍照記錄特定位置細胞的生長遷移能力。
通過不同分組之間的細胞對于劃痕區修復能力的不同，可以判斷各組細胞的遷移與修復能力的差別。
二、步驟
1、準備：
所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和 marker 筆在操作前紫外照射 30 min（超凈臺內）
2、流程：
1. 培養板劃線：先用 marker 筆在 6 孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔 0.5~1 cm 一道，橫穿過孔，每孔至少穿過 5 條線；
2. 鋪細胞：在孔中加入約 5×105 個細胞，具體數量因細胞不同而不同，掌握為過夜能鋪滿；
3. 細胞劃線：第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜；
4. 洗細胞：用 PBS 洗細胞 3 次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基；
5. 細胞培養及觀察：放入 37℃、5% 二氧化碳培養箱，培養；按 0，6，12，24 小時取樣，倒置顯微鏡觀察特定位置細胞遷移情況并拍照；
6. 結果分析：使用 Image J 軟件打開圖片后，隨機劃取 6-8 條水平線，計算細胞間距離的均值。
三、注意事項
1、鋪細胞最好使用 6 孔板，因為 6 孔板可以保證有相當距離的平直劃痕，而且因為有 5 條定位線，與劃痕相交，這樣就有10 個可固定監測點，不作重復，誤差也很小。
2、如果你連續監測 24 小時，你需要考慮到劃痕縮小是細胞遷移和細胞繁殖共同作用的結果，而不是單純的細胞遷移。
如果你要單純的考慮細胞遷移，你可以先用（1 ug/ml）處理一小時，抑制細胞的分裂，這樣你的結果就是細胞遷移的作用了。另外，使用無血清培養基也可以降低增殖對實驗結果的影響。
3、照片拍完之后，可以用 ImageJ 來測量劃痕區域的像素定量比較細胞遷移的速度。
4、雖然無血清培養可以忽略細胞增殖的影響，但是由于細胞內信號傳導系統整體性的下調節，細胞遷移的速度也會慢很多。
5、應盡量清洗掉散落的細胞，對于一些細胞，低血清濃度下也能重新貼壁并增殖，此外也影響數據美觀。
四、常見問題
1.劃痕法測量適用的細胞范圍較小，一般只適用于上皮細胞，纖維樣細胞。
2.雖然無血清培養可以忽略細胞增殖的影響，但是由于細胞內信號傳導系統整體性的下調節，細胞遷移的速度也會慢很多。
3、在用 PBS 緩沖液沖洗時，注意貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細胞，影響實驗拍照結果。
4、一般做劃痕實驗，需要排除細胞增殖的影響，一般在不影響細胞增殖的情況下采用低血清（<2%）或者無血清，否則細胞增殖就不能忽略，這樣對于遷移較慢的細胞就需要延長拍攝時間（也可用絲裂酶處理一小時）。
5、按照 6 孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點，作為固定的檢測點，以解決了前后觀察時位置不固定的問題。
6、每次拍照前、后，盡量換掉培養基，去除飄落的細胞，能得到較為干凈的劃痕區域。